Diplomarbeit August 1996
"Identifizierung von Protein-Interaktionen mit dem ABC-Transporter Ste6"

Einleitung
Der ABC-Transporter Ste6 der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae wird für die Sekretion des Paarungspheromons a-Faktor benötigt. Die Familie der ABC-Transporter umfaßt viele Transportproteine, die sowohl in Prokaryonten als auch in Eukaryonten anzutreffen sind (Higgins, 1992). Typisch für ABC-Transporter ist eine hochkonservierten ATP-Bindungskassette. Bedeutende eukaryontische Vertreter sind die MDR- und CFTR-Proteine bei Säugern. MDR-Proteine sind verantwortlich für das Phänomen der „multidrug resistance", einer breitgefächerten Resistenz gegen zytotoxischer Substanzen, die weder eine ähnliche Struktur noch gleiche intrazelluläre Wirkorte aufweisen (Gottesman und Pastan, 1993). Dieses Phänomen bereitet große Probleme bei der Chemotherapie von Krebserkrankungen. Ein Defekt im humanen CFTR-Protein führt zu einer der häufigsten Erbkrankheiten, der Zystischen Fibrose (CF). Die häufigste Mutation ist eine Deletion von Phenylalanin 508 (DF508), die zu einer temperaturbedingten Mißlokation des CFTR-Proteins und damit zum Funktionsverlust führt (Denning et al., 1992). Das CFTR-Protein besitzt eine Chloridionen-Kanalfunktion. Außerdem gehören verschiedene prokaryontische Permeasen wie HlyB, OppD, HisP und MalK zur Familie der ABC-Transporter.
Der a-Faktor ist zusammen mit dem zweiten Paarungspheromon der Hefe, dem a-Faktor, verantwortlich für die Initiation des Paarungsprozesses. In diesem Konjugationsprozeß fusionieren die beiden haploiden Zelltypen MATa und MATa der Hefe zu einem dritten Zelltyp, der diploiden MATa/a-Zelle. Die Bildung dieser beiden Oligopeptidpheromone erfolgt zelltypspezifisch; die MATa-Zelle bildet den 12 Aminosäuren langen a-Faktor, die MATa-Zelle sekretiert ein 13 Aminosäuren großes Peptid, den a-Faktor.
Das Paarungspheromon a-Faktor wird kodiert von den Genen MFa1und MFa2 und als 18,5 kDa großes Vorläuferpeptid, dem präpro-a-Faktor (pp-a-F) synthetisiert. Der von MFa1 kodierte Vorläufer enthält vier, das MFa2-kodierte Genprodukt zwei Kopien des reifen Pheromons (Bussey, 1988). Der a-Faktor folgt dem klassischen Sekretionsweg: Der Aminoterminus des a-Faktor-Vorläuferpeptids besitzt eine Signalsequenz, die den Eintritt ins ER vermittelt (Julius et al., 1984). Nach Glykosylierung im ER erfolgt der weitere Transport in den Golgi-Komplex, wo die proteolytische Reifung durch die Serinprotease Kex2 erfolgt, die nach Abspaltung der Pro-Sequenz auch die Kopien des a-Faktors freisetzt (Fuller et al., 1986). Weitere Prozessierungsschritte erfolgen durch die Proteasen Ste13 und Kex1, bis schließlich das reife Pheromon über sekretorische Vesikel freigesetzt wird.
Das Paarungspheromon a-Faktor, ein stark hydrophpobes und farnesyliertes Dodekapeptid von 1,6 kDa, wird hingegen über einen nichtklassischen Sekretionsweg ausgeschleust. Die 36 bzw. 38 Aminosäuren langen Vorläufer werden durch die Gene MFa1 und MFa2 kodiert (Michaelis und Hershkowitz, 1988) und besitzten keine Signalsequenz für den ER-Import. Während der a-Faktor in ts-sekretionsdefekten (sec) Mutanten (Schekman, 1985) bei nichtpermissiver Temperatur nicht sekretiert wird, haben diese Mutationen keinen Einfluß auf die Ausschleusung des a-Faktors. MATa ste6-Deletionsmutanten produzieren zwar den reifen a-Faktor, können ihn aber nicht ausschleusen (McGrath und Varshavski, 1989; Kuchler et al., 1989). Dies legt die Annahme nahe, daß der ABC-Transporter Ste6 den Transport des a-Faktors über die Plasmamembran vermittelt. Die enge Verwandtschaft des mutmaßlichen a-Faktor-Transporters Ste6 zu ABC-Transportern in Säugern wird belegt durch den Befund, daß der Paarungsdefekt in einem ste6-Deletionsstamm durch die Expression des mdr3-Gens der Maus komplementiert werden kann (Raymond et al., 1992). Somit stellt Ste6 ein ideales Modell zur Untersuchung eukaryontischer ABC-Transporter dar.
Die aufgrund von Sequenzdaten vorhergesagte Sekundärstrukur und Membrantopologie von Ste6 ähnelt der Struktur anderer Vertreter der ABC-Transporterfamilie. Typisch ist die Struktur der beiden homologen Hälften des Proteins, die durch eine kurze Spacer-Region verbunden sind (Abb. 1). Jede dieser beiden Hälften besteht aus sechs Transmembrandomänen und einer hochkonservierten zytoplasmatischen ATP-Bindedomäne (Kuchler et al., 1989; McGrath und Varshavski, 1989).
Die etwa 100 Aminosäuren lange Spacer-Region von Ste6 wurde „Degradation-Box" oder kurz „D-Box" genannt, da sowohl eine komplette Deletion als auch ein Austausch dieser Region gegen die entsprechende Domäne des prokaryontischen ABC-Transporters HlyB zu einer Stabilisierung des kurzlebigen Ste6 führt (R. Kölling, persönliche Mitteilung). Die D-Box kann unterteilt werden in einen ersten Abschnitt, in dem sich gehäuft saure Aminosäuren befinden, kurz „A-Box" genannt, und einen Teil, „B-Box" genannt, in dem vorwiegend basische Aminosäuren in zwei Blöcken anzutreffen sind. (Abb. 2).
Mit einer Halbwertszeit von rund 13 min ist Ste6 ein sehr kurzlebiges Protein. Es konnte gezeigt werden, daß das Ste6-Protein hauptsächlich in der den Lysosomen der Säugerzellen analogen Vakuole abgebaut wird. In pep4-Mutanten, die einen Defekt in der vakuolären Proteinase A aufweisen, die von zentraler Bedeutung für die proteolytische Funktion der Vakuole ist (Ammerer et al., 1986), steigt die Halbwertszeit von Ste6 stark an. Außerdem konnte durch Immunofluoreszenz in pep4-Mutanten eine Akkumulation von Ste6 in der Vakuole nachgewiesen werden (Kölling und Hollenberg, 1994).
Aufgrund der vermuteten Rolle von Ste6 als a-Faktor-Transporter wurde eine Lokalisation in der Plasmamembran postuliert. Tatsächlich ist Ste6 hauptsächlich mit internen Membranen assoziiert (Kölling und Hollenberg, 1994). Die geringe Menge von Ste6 in der Plasmamembran kann durch eine effiziente Endozytose des Proteins erklärt werden. In der Endozytosemutante end4, die einen Defekt in der Internalisation des a-Faktors aufweist (Raths et al., 1993), häuft sich Ste6 in der Plasmamembran in einer ubiquitinierten Form an (Kölling und Hollenberg, 1994).
Ubiquitin, ein kleines Molekül von 76 Aminosäuren und 8,5 kDa, ist in allen eukaryontischen Zellen vorhanden und spielt eine wichtige Rolle beim kontrollierten Abbau von Proteinen. Hierbei wird das carboxyterminale Glycin des Ubiquitins kovalent mit der e-Aminogruppe eines Lysins verknüpft. Hierzu wird das Ubiquitin zunächst von einem E1 genannten Enzym durch Ausbildung einer energiereichen Thioester-Bindung aktiviert. Das aktivierte Ubiquitin wird dann auf eine Sulfhydrylgruppe eines Ubiquitin-konjugierenden Enzyms (E2) übertragen, das entweder allein oder in Verbindung mit einer Ubiquitin-Ligase (E3) die Übertragung auf das Zielprotein katalysiert. Schließlich werden weitere Ubiquitinmoleküle gebunden. Auf diese Weise wird das Substrat für den Abbau durch den 26S-Proteasomkomplex markiert (Jentsch, 1992). Die Beobachtung, daß Ste6 in ubc4 ubc5 Doppelmutanten (Seufert und Jentsch, 1990), die defekt sind in den Ubiquitin-konjugierenden Enzymen Ubc4 und Ubc5 (E2-Enzyme), um das dreifache stabilisiert ist (Kölling und Hollenberg, 1994), liefert einen Hinweis auf die Beteiligung des Ubiquitinsystems am Abbau von Ste6.
Der genaue Zusammenhang zwischen Ubiquitinierung und dem Abbau in der Vakuole konnte noch nicht näher geklärt werden. Die Proteolyse von Ste6 scheint jedoch trotz Ubiquitinierung nicht vom Proteasom abhängig zu sein, da Proteasom-Mutanten (pre) keinen Einfluß auf die Stabilität von Ste6 haben (R. Kölling, persönliche Mitteilung). Möglicherweise wird die schnelle Endozytose durch die Ubiquitinierung ausgelöst, und führt letztlich zum Abbau in der Vakuole. Ein solcher Mechanismus wurde beschrieben für Ste2, ein G-Protein gekoppeltes Rezeporprotein in der Plasmamembran (Hicke und Riezman, 1996). Die Bindung des a-Faktors an Ste2 aktiviert einen Signaltransduktionsweg und führt zur Ubiquitinierung des Proteins. Diese Ubiquitinierung leitet die Endocytose des Rezepor-Ligandenkomplexes ein. Die Internalisation wird erleichtert durch Clathrin (Tan et al., 1993) und benötigt außerdem Actin, Fimbrin und Calmodulin (Riezmann, 1993; Munn und Riezmann, 1994). Calmodulin, ein regulatorisches Protein, das an vielen calciumabhängigen Signalwegen beteiligt ist, moduliert die Aktivität anderer Proteine, darunter Proteinkinasen, Phosphodiesterasen und Calciumpumpen, bindet Ca2+ spezifisch und erfährt dabei eine Konformationsänderung. Calmodulin bindet mit hoher Affinität an basische, amphipathische a-Helices (O’Neil und DeGrado, 1990). Eine solche Helix besitzt in ihrer räumlichen Orientierung die geladenen und hydrophilen Aminosäuren auf der einen und die hydrophoben Aminosäuren auf der anderen Seite.
Ziel der a-Faktor stimulierten Ubiquitinierung von Ste2 ist die Aminosäuresequenz „SINNDAKSS" im zytoplasmatischen Teil des Proteins; ein Austausch des Lysins zu Arginin, wodurch die positive Ladung erhalten bleibt, verhindert die Ubiquitinierung eines C-terminal verkürzten Rezeptors (Hicke und Riezmann, 1996). Die A-Box von Ste6 weist eine ähnliche Aminosäuresequenz auf, die „DAKTI"-Sequenz (Abb. 2). Tatsächlich ist die A-Box Ziel der Ubiquitinierung, und eine Deletion der A-Box führt zu einer Stabilisierung des Proteins bei Erhalt der Funktion von Ste6 (Ralf Kölling, persönliche Mitteilung).
Es ist unklar, ob Ste6 ausschließlich über den Umweg zur Plasmamembran in die Vakuole gelangt. Einen Hinweis auf die Beteiligung mehrerer Transportwege lieferte die Beobachtung der Ste6-Stabilität in Sekretionsmutanten. In einer sec1-Mutante (Novick und Schekman, 1979), die einen Defekt im Transport der sekretorischen Vesikel zur Plasmamembran aufweist, ist Ste6 zwar stablilisiert, aber bei weitem nicht so stark wie im pep4-Hintergrund (R. Kölling, persönliche Mitteilung). Dies ist ein Hinweis auf zwei alternative Transportwege für Ste6, die beide in der Vakuole enden. Zwei mögliche Wege, über die Membranproteine zur Vakuole gelangen können, sind zum einen der Transport von Membranproteinen nach Integration in die ER-Membran zum Golgi-Apparat, von dem sie über ein Endosomen-Kompartiment, auch prävakuoläres Kompartiment genannt, zur Vakuole gelangt. Diesem vakuolären Transportweg folgt z.B. die Dipeptidylaminopeptidase B, kurz DPAP B. (Roberts et al., 1992; Review von Conibear und Stevens, 1995). Ein anderer Weg weicht nach dem Golgi-Apparat von dem eben beschriebenen ab. Hier erfolgt der Transport des Proteins zur Plasmamembran und von dort durch Endozytose über mehrere endosomale Kompartimente (Singer-Kruger et al., 1993) zur Vakuole. Im Gegensatz zu Säugerzellen scheinen in S. cerevisiae Membranproteine, die nicht über spezifische Sorting-Signale verfügen, mit deren Hilfe die zelluläre Sortierung erfolgt, über das Endosom unter Umgehung der Plasmamembran in die Vakuole transportiert zu werden (Roberts et al., 1992).
Im Rahmen dieser Diplomarbeit sollte mit Hilfe des Two Hybrid-Systems untersucht werden, ob und mit welchen Proteinen die D-Box und Teile der D-Box interagieren. Beim Two Hybrid-System handelt es sich um ein genetisches System zur Detektion von Proteinwechselwirkungen in vivo, welches gleichzeitig eine schnelle Identifizierung der positiv beurteilten Klone erlaubt (Fields und Song, 1989). Das Prinzip beruht auf dem modularen Charakter vieler eukaryontischer Transkriptionsfaktoren, wie dem hier verwendeten Gal4 (Ma und Ptashne, 1987), das beteiligt ist an der positiven Regulation von Genen zur Galaktoseverwertung in S. cerevisiae. Die Gal4-DNA-Bindedomäne (BD) bindet sequenzspezifisch an eine cis-regulatorische, palindromische Sequenz in der Nähe der Promotorregionen der GAL-Gene, die als UAS (upstream activating sequence) bezeichnet wird. Die Gal4-Aktivierungsdomäne (AD) interagiert mit anderen für die Transkriptionsinitiation benötigten Faktoren und bewirkt so die Transkription des stromabwärts liegenden Gens (Johnston, 1987). Die verwendeten Hefestämme besitzen Cassetten mit Reportergenen (HIS3 und E. coli lacZ), die von Promotoren exprimiert werden, die unter Kontrolle des GAL1-UAS-Elements stehen. Auf Plasmiden werden zwei Gene kloniert, die Hybridproteine kodieren: Eines ist eine Fusion aus der GAL4-Bindedomäne und einem Protein „X", das andere ist eine Fusion aus der GAL4-Aktivierungsdomäne und einem Protein „Y". Durch eine physikalische Interaktion der beiden Proteine X und Y kann die Gal4-Aktivität wiederhergestellt werden (Abb. 3); die getrennten Gal4-Domänen allein sind dazu nicht in der Lage (Fields und Song, 1989). Die Expression des HIS3-Reportergens bewirkt Wachstum der Zellen auf Medium ohne Histidin, die Expression der b-Galaktosidase kann mit einem Filtertest nachgewiesen werden (Blaufärbung durch die enzymatische Spaltung von X-Gal).
Das Two Hybrid-System erlaubt nicht nur die Untersuchung spezifischer Hybridproteine. Um diese Methode für eine Suche nach bislang unbekannten Interaktionspartnern einzusetzten, kann eine Hybridprotein-Bank hergestellt werden, indem die gesamte genomische DNA oder cDNA an die kodierende Sequenz der Gal4-AD fusioniert wird. Diese Bank kann in eine Hefe transformiert werden, die bereits ein Plasmid enthält, das ein spezifisches Gal4-BD-Fusionsprotein kodiert (Bartel, 1993). Sollte bei einer solchen Suche ein Interaktionspartner gefunden werden, genügt zur Identifizierung des Proteins die Sequenzierung des GAL4-AD-Fusionsgens.
Geplant war die Suche nach unbekannten Faktoren, die mit der D-Box interagieren. Außerdem sollten mögliche Wechselwirkungen gezielt untersucht werden: Die basischen Bereiche der B-Box können als amphipathische a-Helix dargestellt werden und stellen somit eine mögliche Bindungsstelle für Calmodulin dar (O’Neil und DeGrado, 1990). Außerdem sollte untersucht werden, ob die B-Box, deren Aminosäuresequenz eine Ähnlichkeit zum a-Faktor-Rezeptor Ste3 aufweist, eine a-Faktor-Bindungsstelle besitzt.
In einem weiteren Projekt sollten Mutanten isoliert werden, die zu einer Stabilisierung des Ste6-Proteins führen. Solche Mutanten könnten hilfreich sein bei der Aufklärung der Abbauwege von Ste6. Zu erwarten wären Mutanten des sekretorischen Transportwegs und auch solche mit Einfluß auf die proteolytische Funktion der Vakuole. Auch ubiquitinkonjugierende Proteine oder Komponenten des vakuolären Transportwegs könnten so identifiziert werden.
Ein verminderter Abbau von Ste6 in solchen Mutanten sollte zu einer höheren intrazellulären Ste6-Konzentration führen. Da sich die Ste6-Aktivität im Rahmen eines genetischen Screens nicht ohne weiteres quantifizieren läßt, sollte ein Ste6-lacZ-Fusionsprotein benutzt werden. Über die b-Galaktosidaseaktivität des Fusionsproteins sollten sich so mit Hilfe eines Filtertests Mutanten isolieren lassen, die eine erhöhte Ste6-Stabilität aufweisen. Zuvor muß jedoch geklärt werden, ob sich das Fusionsprotein wie Ste6 verhält.
  Zusammenfassung
 Die vorliegende Diplomarbeit beschäftigte sich mit der Charakterisierung möglicher Wechselwirkungen mit der Spacer-Region des ABC-Transporters Ste6 aus S. cerevisiae, auch D-Box genannt. Verwendet wurde das Two Hybrid-System. So konnte gezeigt werden, daß die D-Box nicht interagiert mit Calmodulin. Es wurden Hinweise gefunden auf eine mögliche Wechselwirkung zwischen dem Paarungspheromon a-Faktor und einem basischen Bereich der D-Box, der B-Box. Aufgrund eines Wachstumsdefekts, der durch das verwendete Gal4-Bindedomänenplasmid hervorgerufen wurde, ist eine abschließende Beurteilung jedoch nicht möglich. Sollten sich die Hinweise auf die Interaktion mit dem a-Faktor bei der Verwendung eines bereits neu kontruierten Bindedomänenplasmids bestätigen, so können wertvolle Informationen auf die Funktion des vermeindlichen a-Faktortransporters Ste6 gewonnen werden.
Um den schnellen Umsatz und die Abbauwege von Ste6 zu untersuchen, konnte ein Screen nach Mutanten, in denen Ste6 stabilisiert ist, etabliert werden. Grundlage ist ein Ste6-lacZ-Fusionsprotein, wodurch die erhöhte Proteinmenge anhand der b-Galaktosidaseaktivität nachgewiesen werden kann. Es konnte gezeigt werden, daß das Fusionsprotein biologisch voll aktiv ist, also in Abwesenheit des Wildtypproteins die Sektretion des a-Faktors vermittelt. Außerdem verhält sich das Fusionsprotein in wesentlichen Punkten wie das Wildtypprotein: Zellfraktionierungsexperimente mit Sucrosegradienten haben gezeigt, daß beide Proteine hauptsächlich mit internen Membranen assoziiert sind und sich in der Endocytosemutante end4 der Plasmamembran anhäufen. Ebenso wie Ste6, ist auch Ste6-lacZ in einer pep4-Mutante, in der die proteolytische Funktion der Vakuole gestört ist, stabilisiert. Nach einer Mutagenese mit EMS konnten rund 30 Mutanten mit erhöhter b-Galaktosidaseaktivität isoliert werden. Mit Pulse-Chase-Experimenten konnte nachgewiesen werden, daß fünf Mutanten mit besonders hoher b-Galaktosidaseaktivität auch das Wildtypprotein stabilisieren. Durch Transformation mit einer cDNA-Bank und Rückkreuzungsexperimente konnte eine der Mutanten als pep4-Stamm identifiziert werden. Durch die Identifizierung einer Mutante, deren stabilisierender Effekt bereits bekannt ist, wurde die Brauchbarkeit des Screens bewiesen. Weitere Mutanten, in denen Ste6 noch stärker stabilisiert ist als in pep4-Zellen, stehen für künftige Untersuchungen zur Verfügung.

Dissertation
"Identifizierung von Protein-Interaktionen mit dem ABC-Transporter Ste6"

Zusammenfassung
 Um Funktionen zu identifizieren, die am intrazellulären Transport und Turnover von Membranproteinen beteiligt sind, wurde ein Screen nach Funktionen durchgeführt, welche den Transport von Ste6 in die Vakuole bei Überproduktion blockieren. Ste6 ist ein kurzlebiges, ubiquitiniertes Membranprotein, das in der Vakuole abgebaut wird. Dabei konnten bekannte VPS-Gene ("vacuolar protein sorting") identifiziert werden, die Bestandteile von Proteinkomplexen sind: VPS35, VPS32/SNF7 und VPS4. Außerdem wurde ein noch unbekanntes Gen isoliert, welches den Namen MOS1 ("more of Ste6") erhielt. SNF7 und VPS4 gehören zu den sogenannten "class E"-VPS-Genen, bei denen der Transport zwischen einem spät-endosomalen Kompartiment und der Vakuole blockiert ist. Es konnte gezeigt werden, dass auch ein mos1-Deletionsstamm einen "class E"-Phänotyp aufweist: Die Reifung der vakuolären Hydrolase CPY ist verzögert, und der endozytische Marker FM4-64 häuft sich in einer halbmond-, punkt- oder ringförmigen Struktur in direkter Nähe der Vakuole an. Immunfluoreszenzexperimente und die Verteilung eines Ste6-GFP-Fusionsproteins zeigten, dass sich Ste6 in der gleichen Struktur anhäuft. In Fraktionierungsexperimenten wurde gezeigt, dass rund die Hälfte des hydrophilen Proteins Mos1 mit Membranen assoziiert. In Fraktionierungsexperimenten mit Sucrosedichtegradienten kofraktioniert Mos1 mit dem endosomalen t-SNARE Pep12, was auf eine endosomale Lokalisation von Mos1 hindeutet. Im Two Hybrid-System konnte ein bislang unbekanntes Membranprotein identifiziert werden, dass als Interaktionspartner von Mos1 möglicherweise dessen Membranassoziation erlaubt. Sequenzanalysen haben gezeigt, dass Snf7 und Mos1 zu einer Familie von "coiled-coil"-bildenden Proteinen gehören. Zu dieser Familie gehört noch ein weiteres bislang unbekanntes Protein, das den Namen Mos2 erhielt. Der Verlust der MOS2-Funktion führte ebenfalls zu einem "class E"-Phänotyp und zur Stabilisierung von Ste6. Verschiedene Mutanten der "Snf7-Familie" zeigten unterschiedliche Wachstumsphänotypen. Dies deutet darauf hin, dass die einzelnen Proteine den Transport unterschiedlicher Substrate vermitteln.
Weitere Faktoren, die möglicherweise an der Regulation des Ste6-Transports und Turnovers beteiligt sind, konnten mit dem Two Hybrid-System identifiziert werden. Sie interagieren mit einem Bereich von Ste6, der die Ubiquitinierung von Ste6 vermittelt. Einige dieser Faktoren, eine Kinase und zwei Untereinheiten einer Phosphatase, könnten die Phosphorylierung von Ste6 beeinflussen. Da für andere Oberflächenproteine eine positive Regulation der Ubiquitinierung durch Phosphorylierung berichtet wird, handelt es sich bei den gefundenen Proteinen möglicherweise um Regulatoren des schnellen Turnovers von Ste6.


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